正常组织来源的细胞在体外培养条件下可分裂生长,但经过有限次数的传代后,就会停止增殖,发生衰老和死亡,这种现象称之为海弗利克极限。细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离, 从而具有无限增殖能力的过程称为细胞永生化(cell immortalization) 。
与正常细胞相比,永生化细胞具有以下优点:
1. 可使传代次数少、增殖慢、易分化衰老的细胞获得永生,且永生化后更易于培养,节省培养成本,在短时间内可大量扩增,为研究提供充足的细胞;
2. 永生化细胞可建立稳定细胞库,基因表型稳定均一,有助于得到一致且可重复的实验结果,是体外研究细胞增殖、分化、凋亡、衰老等的理想模型;
3. 永生化细胞和肿瘤细胞关系密切,可以为肿瘤发生机制的研究提供重要参考。
使细胞获得永生化的方法主要是从基因组层面对细胞进行一定改造。
主要途径有:
1)放射性或药物诱导
2)激活原癌基因
3)使抑癌基因失活
4)慢病毒、EB病毒等
5)整合端粒酶催化亚基。
本公司可以为客户提供永生化慢病毒包装,细胞感染,单克隆挑选以及表型鉴定等多项相关服务
注意: 本服务仅用于进一步科研使用,不可用于临床治疗等其他用途。
慢病毒(Lentivirus)载体是常用的基因整合工具,属于假性病毒,免疫源性低,可有效感染分裂和非分裂细胞,感染宿主细胞后,慢病毒基因可反转录整合到宿主细胞染色体中,实现长时间稳定表达,目前广泛应用于基因敲除、敲入、基因过表达、RNA干扰等研究。
通过在慢病毒载体上插入永生化基因及抗性筛选基因,可获得永生化慢病毒载体。感染后,在培养基中加入对应的抗生素,未完成感染的细胞由于缺乏抗性被清除,感染成功的细胞获得抗性,继续存活。经过一段时间的筛选后,可获得带有抗性及永生化基因的细胞。
单克隆筛选是将单个细胞从混合的细胞样品中分离出来的一种技术,从单个细胞扩增出来的细胞株具有基因表型稳定、性状统一等优点,广泛应用于是抗体制备细胞株优化、稳转细胞株构建、药物靶点筛选等。具体方法有流式细胞术挑选、有限稀释法、半固体培养基挑选法,主要难点在于将细胞分离出来并持续扩增。
永生化成功的标志:细胞表型未发生转化(形态观察以及标志物检测);细胞可以持续稳定地分裂(与原代细胞同步传代验证)。
客户提供原代细胞,告知所用培养基及培养方法,沟通确定所用病毒载体后,本公司可按下列步骤完成细胞永生化服务。
通过客户提供的方法将细胞培养到良好状态
利用载有荧光蛋白基因的对照慢病毒摸索感染条件,再利用带有抗性基因、永生化基因的慢病毒对细胞进行感染。
用所选抗生素对感染后的细胞进行一段时间的筛选。
通过有限稀释法、流式细胞术等方法进行单克隆筛选,经过两三个月的培养,使单个细胞扩增到长满T25瓶。
定制永生化细胞系可以根据您的要求进行表型和功能的验证,通过qPCR、Western Blot、免疫荧光等方法,检测mRNA表达及蛋白质表达,也可额外进行功能测定。